本文標題："微生物樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測分析顯微鏡"
發布者：yiyi ------ 分類: 行業動態 ------
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微生物樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測分析顯微鏡
當降解的DNA成為模板時，由于模板重建形成的競爭，完整模板較低的起始
反應濃度，抑制效應都將導致檢測不到PCR產物的存在。較強的或部分的抑
制效應可以按上面討論過的PCR產物二次純化加以消除或者用一系列稀釋的
提取液作為模板。由于模板的片段性導致的低效率PCR擴增或缺乏產物可以
通過初步的無引物的聚合反應重建及隨后的特異PCR加以克服。另外，可以
設計的一組PCR反應，起始PCR反應后所產生的產物作為第二次反應的模板
，而所用的引物是第一次反應引物內側的引物。
實際的擴增反應必須采用標準的程序，用上述兩步嵌合反應的方法，2
5山的反應體系中，包含72．5pmoles的正向和反向引物，0．2mmolesdNTP
，1．25UTaq酶，2．5P，產品供應商提供的?0 X反應緩沖液和2P，的DNA提
取液，MgCI：的濃度必須通過實驗決定(盡管3mM是標準的起始反應濃度)。
復性溫度，變性、復性和延伸時間取決于熱循環儀的機型、目標片段的長
度及引物的不同。盡管理論上說某些具有3+—5’的外切酶活性的DNA聚合
酶利于長片段的擴增和重建，但我們不能證明使用那些酶比標準Taq酶有什
么優越性(Nixon&Golenberg，未發表)。
一次性空氣過濾的槍頭經常用于防止交叉污染。類似的，所有的試劑
都應該分裝成小量，這樣可以檢查和易于校正任何被污染了的溶液。除了
酶和模板DNA外的所有試劑應混勻，放在冰上，暴露在短波紫外光下使溶液
中任何雙鏈DNA形成嘧啶二聚體。這將阻止潛在污染DNA的擴增。為了避免
接觸不必要的污染，首輪PCR反應液可以不作電泳檢測在第二輪或者嵌合PC
R反應后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。在嵌合PCR過程中，第二輪反應的引物
應合成至第一輪反應所用正向引物和反向引物的3+端，加上1 P，的初次反
應產物作模板，并使用50P，的反應體積，以保證足夠的PCR產物用于最后
測序，反應溫度和時間必須按照新的引物和反應體積加以調整。第二次擴
增以后，用5 P，的反應產物以瓊脂糖凝膠和溴化乙錠電泳檢測PCR產物的
存在及其片段大小。
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