使用原子力顯微鏡(AFM)觀察生化過(guò)程

　　隨著樣品處理技術(shù)在液體中成像技術(shù)的改善，應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）觀察復(fù)雜的生化過(guò)程成為可能。轉(zhuǎn)錄過(guò)程是基因表達(dá)的中心環(huán)節(jié)，而使用原子力顯微鏡（AFM）觀察蛋白質(zhì)和DNA的相互作用存在一個(gè)矛盾要解決：生物分子需要固定到基底上是原子力顯微鏡（AFM）的成像基礎(chǔ)，而生化反應(yīng)過(guò)程卻需要生物分子能相對(duì)自由地移動(dòng)。即使在大量非特異性DNA存在時(shí)，RNA聚合酶（RNAP）與啟動(dòng)子間仍存在很高的結(jié)合率，人們猜想RNAP沿著DNA的擴(kuò)散是其原因之一。非特異性復(fù)合物在適當(dāng)條件下沉積后，利用原子力顯微鏡（AFM）可觀察到RNAP沿著DNA滑動(dòng)，且能在不同的DNA片段間轉(zhuǎn)移。然而加入肝素可終止這些過(guò)程，這就進(jìn)一步證實(shí)了RNAP-DNA相互作用的非特異性。原子力顯微鏡（AFM）還能對(duì)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，在加入核苷酸后，沉積到云母上的延長(zhǎng)復(fù)合物沿著DNA模板單向移動(dòng)。兩個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNAP與DNA的相對(duì)移動(dòng)與轉(zhuǎn)錄的實(shí)際情況相符。在一個(gè)對(duì)照中，以沒(méi)有終止子的微環(huán)DNA作為模板，在云母上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在干燥后通過(guò)原子力顯微鏡（AFM）可觀察到合成的ＲＮＡ長(zhǎng)鏈。在第二個(gè)對(duì)照中，DNA在相同的條件下，在云母上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。不同的是加入的核苷酸用32Ｐ標(biāo)記。

　　通過(guò)PAGE對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與云母結(jié)合的復(fù)合物具有活性，而且轉(zhuǎn)錄的速度與用原子力顯微鏡（AFM）測(cè)得的近似生物分子的構(gòu)象改變也是原子力顯微鏡（AFM）的重要觀察內(nèi)容。將尿素酶沉積到云母上并用原子力顯微鏡（AFM）掃描，在液池中加入尿素后發(fā)現(xiàn)，懸臂的垂直波動(dòng)明顯增加，這提示由酶活動(dòng)引起的構(gòu)象改變能直接通過(guò)原子力顯微鏡（AFM）記錄下來(lái)。格蘭陰性菌的外膜是其保護(hù)屏障，它由規(guī)則組裝的蛋白質(zhì)通道構(gòu)成。其中研究較多的是Deinococcusradiodurans的六角形組裝中間體（hexagonallypackedintermediate，HPI）蛋白。HPI被認(rèn)為與營(yíng)養(yǎng)的攝入和代謝物的排出有關(guān)。HPI的原子力顯微鏡（AFM）圖像顯示了規(guī)則的六角形及中央的孔樣結(jié)構(gòu)。在液體中成像則發(fā)現(xiàn)HPI呈現(xiàn)出“開(kāi)和“關(guān)”兩種不同的構(gòu)象。意義雖不清，但這卻顯示出原子力顯微鏡（AFM）在液體中成像的優(yōu)勢(shì)。

　　原子力顯微鏡（AFM）在研究分子識(shí)別中的應(yīng)用分子間的相互作用在生物學(xué)領(lǐng)域中相當(dāng)普遍，例如受體和配體的結(jié)合，抗原和抗體的結(jié)合，信息傳遞分子間的結(jié)合等，是生物體中信息傳遞的基礎(chǔ)。原子力顯微鏡（AFM）可作為一種力傳感器來(lái)研究分子間的相互作用。這是由于原子力顯微鏡（AFM）理論上能感應(yīng)10-14Ｎ的作用力，能感應(yīng)0.01ｎｍ的位移，而接觸面積可小到10ｎｍ2。因此，原子力顯微鏡（AFM）被用于研究互補(bǔ)的DNA鏈間、細(xì)胞粘附分子間及配體-受體間的相互作用力。生物素（biotin）和抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）間有高親和力，其相互作用的熱力學(xué)數(shù)據(jù)也較為清楚。因而，生物素和抗生物素蛋白鏈菌素是原子力顯微鏡（AFM）測(cè)定特異相互作用力的良好典型。在一經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，用生物素化的小牛血清白蛋白（biotinlatedbovineserumalbumin，BBSA）包裹微球，而微球連在懸臂上形成BBSA功能化探針。然后在有生物素阻斷和無(wú)生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中測(cè)量BBSA功能化探針和BBSA包裹云母間的粘附力。

　　結(jié)果顯示，無(wú)生物素阻斷的抗生物素蛋白鏈菌素溶液中需要較大的力才能將BBSA功能化探針與云母表面分離，力的大小為（0.257±0.025）ｎＮ，與分離配體-受體所需的力相符。而在此基礎(chǔ)上可推算出其有效的斷裂距離為（0.95±0.10）ｎｍ。因此，當(dāng)針尖包裹了特定的分子（如生物素）后，通過(guò)針尖和樣品間的相互作用可用于辨認(rèn)表面的相應(yīng)分子（如抗生物素蛋白鏈菌素）的位置。現(xiàn)在已出現(xiàn)了商用的修飾探針，這些探針包裹了不同的分子，可用于不同用途的分子識(shí)別。因而原子力顯微鏡將發(fā)揮更廣泛的作用。原子力顯微鏡（AFM）在物質(zhì)超微結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用原子力顯微鏡（AFM）可以直接觀察到表面缺陷、表面重構(gòu)、表面吸附體的形態(tài)和位置、以及有表面吸附體引起的表面重構(gòu)等。原子力顯微鏡（AFM）可以觀察許多不同材料的原子級(jí)平坦結(jié)構(gòu)，例如，可以用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)DL－亮氨酸晶體進(jìn)行研究，可觀察到表面晶體分子的有序排列，其晶格間距與X射線衍射數(shù)據(jù)相符。另外原子力顯微鏡（AFM）還成功地用于觀察吸附在基底上的有機(jī)分子和生物樣品，如，三梨酸、DNA和蛋白質(zhì)的表面。

　　海藻酸聚賴氨酸海藻酸（AlginatePolyL-LysineAlginate，簡(jiǎn)稱APA）膠囊薄膜具有半滲透性，構(gòu)成可以阻止人體免疫系統(tǒng)的成分進(jìn)入由APA薄膜構(gòu)成的膠囊，從而使得膠囊內(nèi)的物質(zhì)免受免疫系統(tǒng)的侵害。因此，可采用該薄膜膠囊保護(hù)人體內(nèi)移植的組織，延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的存活時(shí)間。同時(shí)，對(duì)藥物具有緩釋效應(yīng)。APA薄膜的半滲透性同其表面的超微結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系，研究其表面的超微結(jié)構(gòu)對(duì)其半滲透性的研究具有重要的意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于采用原子力顯微鏡（AFM）對(duì)APA薄膜的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)了APA表面的特殊結(jié)構(gòu)，從而揭示了APA表面超微結(jié)構(gòu)對(duì)半滲透性的重要意義。目前，利用原子力顯微鏡（AFM）已獲得了DNA、透析薄膜、烷烴分子、脂肪酸薄膜以及多糖等的超微結(jié)構(gòu)的圖象。